技术原理与设计相关的缺点
a) 交叉反应
这是DNA芯片最核心的技术缺陷之一。
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- 原理： 芯片上的探针序列与样本中非目标序列发生不完全匹配的结合。
- 后果： 导致假阳性信号，即检测到了不存在的基因表达，一个基因的家族成员或序列高度相似的基因可能会被同一个探针同时检测到，从而掩盖了真实的目标信号，影响了结果的准确性，虽然生物信息学可以通过设计特异性更高的探针来缓解,但无法完全消除。
b) 探针设计依赖性强且存在偏差
- 依赖先验知识： 探针的设计完全依赖于已知的基因组序列信息，对于非模式生物（即基因组未测序或测序不完整的物种）,设计和合成特异性探针变得非常困难甚至不可能。
- 序列偏差： 芯片上的探针是基于特定参考序列设计的，如果样本中存在单核苷酸多态性、插入或缺失等变异，探针可能无法有效结合，导致假阴性结果（即漏检了实际存在的基因表达）。
实验流程与操作相关的缺点
a) 样本制备复杂且易引入误差
- 步骤繁琐： 从样本中提取RNA，进行逆转录、荧光标记、纯化等步骤,每一步都可能引入误差或损失。
- RNA质量要求高： RNA极易被RNA酶降解，对实验操作环境和人员要求极高,降解的RNA会导致结果不准确。
- 标记效率差异： 不同样本的标记效率可能不同，这会影响后续杂交信号的强度，需要通过标准化来校正,增加了实验的复杂性。
b) 杂交过程的非特异性
- 背景噪音： 除了交叉反应，样本中的DNA/RNA也可能非特异性地吸附到芯片的基质（如玻璃片）或无关的探针上，产生背景噪音,降低了信噪比。
- 杂交动力学不均一： 不同长度的序列、不同的GC含量以及二级结构都会影响其与探针的杂交效率，长序列杂交更充分，短序列杂交效率低,这会造成信号强度的系统偏差。
数据分析与解读的挑战
a) 数据量大，分析复杂
- 高维数据： 一次实验可以同时检测数万甚至数十万个基因的表达，产生海量数据,处理和分析这些数据需要专业的生物信息学知识和强大的计算资源。
- 多重检验问题： 在分析成千上万个基因的表达差异时，即使没有真实的生物学差异，随机波动也可能导致部分基因的p值显得“显著”，如果不进行严格的统计校正（如Bonferroni校正或FDR校正）,会产生大量假阳性结果。
b) 结果解读困难，生物学意义不明确
- “相关性”不等于“因果性”： 芯片可以显示哪些基因在特定条件下（如疾病 vs. 健康）表达发生了变化，但它本身无法揭示这些基因之间复杂的调控网络和因果关系，一个基因表达上调，可能是原因，也可能是结果,或者是其他事件的伴随现象。
- 功能验证的必要性： 芯片筛选出的候选基因或生物标记物，必须通过后续的实验（如qPCR、Western Blot、基因敲除/过表达等）进行验证，才能确认其功能和意义,芯片本身只是一个筛选工具。
成本与效率问题
a) 初始投资成本高
- 设备昂贵： DNA芯片的扫描仪、点样仪（如果是定制芯片）等设备价格不菲。
- 芯片成本： 虽然商用标准化芯片的单价在下降，但对于小规模研究，其成本仍然高于一些靶向技术（如qPCR）。
b) 灵活性不足
- 一张商业芯片上的探针是预先设定好的，用户无法更改，如果研究焦点是芯片上未包含的基因，或者需要检测新的突变位点,该芯片就无法使用。
- 与靶向技术对比： 相比于可以灵活设计引物来检测任意靶点的qPCR或新一代测序技术,DNA芯片的灵活性较差。
c) 动态范围有限
- 信号饱和： 芯片检测信号的动态范围通常在2-3个数量级（即100倍左右），对于表达量极高或极低的基因，其信号可能会超出检测范围，导致无法准确量化，而RNA-seq等技术拥有更宽的动态范围。
其他缺点
a) 无法检测未知序列
如前所述，DNA芯片是基于“已知-未知”的检测模式，它无法发现全新的、未在数据库中注释的转录本或基因，而RNA-seq则在这方面具有天然优势。
b) 定量精度相对较低
与数字PCR等绝对定量技术相比，DNA芯片的定量通常是相对的,且精度受限于上述的杂交效率和背景噪音等因素。
| 缺点类别 | 具体表现 |
|---|---|
| 技术原理 | 交叉反应导致假阳性；依赖已知序列，难以用于非模式生物；无法检测未知序列。 |
| 实验操作 | 样本制备复杂，易引入误差；对RNA质量要求高；杂交过程存在非特异性和动力学偏差。 |
| 数据分析 | 数据量大，分析复杂；多重检验问题易产生假阳性；结果解读困难，需功能验证。 |
| 成本效率 | 初始设备投入高；灵活性差固定；动态范围有限，对表达量极端的基因检测能力弱。 |
尽管存在这些缺点，DNA芯片技术在过去几十年里极大地推动了基因组学、转录组学和医学研究的发展，随着RNA测序等技术的成熟和成本下降，DNA芯片在许多研究领域（如全基因组表达谱分析）的地位已被取代，在某些特定领域，如基因分型（SNP芯片）或病原体快速检测等，DNA芯片因其快速、高通量和成本效益,仍然具有重要的应用价值。
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