什么是PCR技术？
PCR 的全称是 聚合酶链式反应（英文：Polymerase Chain Reaction）。
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您可以把它想象成一种“基因复印机”或“分子放大器”，它的核心功能是能够在试管里，以极快的速度将特定的DNA片段（哪怕这个片段在样本中微乎其微）精确地复制出数百万甚至数十亿份,从而让我们能够轻松地检测到它。
这项技术由美国生物化学家 凯利·穆利斯（Kary Mullis） 于1983年发明,他也因此项发明获得了1993年的诺贝尔化学奖。
PCR技术的基本原理：DNA如何“复印”？
PCR技术的原理模拟了细胞内DNA自然复制的过程，但将其在体外进行了高度简化和自动化，整个过程分为三个步骤，并且这三个步骤在一个温度可控的仪器（PCR仪或基因扩增仪）中循环进行。
核心三步骤：
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变性 - “打开”DNA双螺旋
（图片来源网络，侵删）- 目的：将作为模板的双链DNA解开成两条单链。
- 方法：将反应体系加热到 94-98℃ 的高温。
- 类比：就像拉开拉链，把两条DNA链分离开,每条链都可以作为复制的模板。
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退火 - “定位”并“粘贴”引物
- 目的：让人工合成的“引物”结合到单链DNA模板的两端。
- 方法：将温度迅速降低到 50-65℃（具体温度取决于引物的序列）。
- 什么是引物？ 引物是一小段（约20个碱基长）的人工合成的单链DNA片段，它们是专门为我们要检测的“目标基因”量身定做的，一端结合在目标基因的上游，另一端结合在下游，像两个“路标”一样,精确地标记出我们想要复印的DNA片段的起点和终点。
- 类比：就像用两个夹子（引物）夹住我们要复印的那一小段文字（目标基因）的两端。
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延伸 - “复印”DNA
- 目的：以DNA单链为模板，沿着引物的方向,合成出新的互补DNA链。
- 方法：将温度升高到 72℃（这是常用耐热DNA聚合酶的最适温度）。
- 关键工具：Taq DNA聚合酶，这是一种从耐热细菌中提取的酶，它就像一个“复印机”，能够从引物的起点开始，沿着DNA模板，一个个地添加DNA碱基（A与T配对，G与C配对）,合成出一条完整的新DNA链。
- 类比：复印机开始工作，从夹子（引物）的位置开始，精确地复印出我们想要的那段文字（新DNA链）。
一个循环的产物是什么？
经过上面三个步骤（一个循环）,一个DNA分子就变成了两个DNA分子。
循环次数与DNA数量的关系：
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- 开始：1个目标DNA分子
- 第1轮循环后：2个
- 第2轮循环后：4个 (2²)
- 第3轮循环后：8个 (2³)
- 第30轮循环后：约10亿个 (2³⁰ ≈ 1,073,741,824)
PCR反应会进行 25-40个循环，在短短2-3小时内,就能将目标DNA片段放大到可检测的浓度。
PCR在核酸检测中的核心应用
PCR技术是核酸检测的基石，它不仅仅能检测DNA，通过一步简单的预处理（逆转录），它还能检测RNA，这就是我们常说的 RT-PCR。
常规PCR (检测DNA)
- 应用：检测特定的病原体DNA（如某些病毒、细菌、寄生虫）、基因诊断（如遗传病筛查）、法医鉴定（DNA指纹）等。
- 局限性：只能告诉我们“有”或“没有”目标DNA,但无法知道初始样本中到底有多少。
实时荧光定量PCR (Real-time Quantitative PCR, qPCR / RT-qPCR) - 这是目前核酸检测的主流！
这是在常规PCR基础上的重大升级,也是新冠检测等技术所采用的核心方法。
- 核心创新：增加了荧光信号。
- 在PCR反应体系中加入荧光探针或荧光染料。
- 荧光探针（如TaqMan探针）更常用、更特异，它是一段带有荧光报告基团和淬灭基团的寡核苷酸探针，当它完整时，荧光被淬灭；当PCR延伸时，Taq酶会“切开”这个探针，释放出荧光报告基团,发出荧光。
- 如何实现“定量”？
- PCR仪在每一个循环结束后都会检测一次荧光强度。
- 随着循环次数的增加，DNA数量增多,荧光信号也不断增强。
- 当荧光信号强度达到某个预设的阈值时，此时的循环数被称为 Ct值（或Cq值）。
- Ct值的意义：
- Ct值与初始模板量成反比。
- Ct值越小，说明样本中一开始就含有大量的目标核酸,病毒载量高。
- Ct值越大，说明样本中目标核酸含量很低,病毒载量低。
- 通过与已知浓度的标准品对比,可以计算出样本中目标核酸的精确含量。
以新冠核酸检测为例：
- 目标：检测新冠病毒的RNA。
- 方法：RT-PCR。
- 样本处理：从患者的鼻咽拭子等样本中提取总RNA。
- 逆转录：使用逆转录酶将病毒的RNA逆转录成互补DNA（cDNA）。
- qPCR扩增：以cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR，通常会针对病毒基因组的多个不同靶点（如N基因、E基因、ORF1ab基因）进行检测,以提高准确性和防止漏检。
- 结果判读：
- 阳性：如果某个或多个靶点的Ct值小于或等于设定的 cutoff 值（如38），则报告为阳性,表明样本中存在新冠病毒核酸。
- 阴性：如果所有靶点的Ct值都大于 cutoff 值，则报告为阴性,表明未检测到病毒核酸。
- 无效：如果内参基因（如人体基因）也未检出,说明样本不合格或实验失败。
PCR技术的优缺点
优点：
- 高灵敏度：可以检测到极低拷贝数的核酸（甚至单个分子）。
- 高特异性：通过设计特异性的引物,可以精确区分高度相似的序列。
- 高效率：数小时内即可完成数亿倍的扩增。
- 自动化：操作简单,易于实现高通量检测。
- 用途广泛：不仅是诊断，还广泛用于科研、农业、考古等领域。
缺点：
- 易受污染：极其微量的目标DNA污染（如之前PCR产物的气溶胶）都可能导致假阳性结果,对实验室环境和操作要求非常严格。
- 无法区分死活病原体：PCR检测的是核酸（DNA或RNA），无论病原体是死是活，只要其核酸片段存在，就可能被检出，这在某些情况下（如治疗后的疗效评估）可能会造成误导。
- 需要仪器和专业人员：虽然自动化程度高,但仍需要专业的PCR仪和经过培训的技术人员来操作和判读结果。
- 可能出现假阴性：如果样本采集不当、病毒载量过低、或引物设计不匹配,可能导致漏检。
PCR核酸检测技术，特别是其升级版实时荧光定量PCR（RT-qPCR），是现代分子诊断的基石，它通过“变性-退火-延伸”的循环，实现了对特定核酸片段的指数级扩增，并结合荧光信号实现了精确定量，凭借其高灵敏度、高特异性的优点，它已成为传染病诊断（如新冠、艾滋病、乙肝）、基因检测和法医学等领域不可或缺的核心工具。
